Estimación de la abundancia de vesículas de membrana externa en bacterias

Abstract

Las vesículas son unas estructuras esféricas de origen membranoso y tamaño muy reducido, aproximadamente 20-250 nm de diámetro, que son liberadas al medio extracelular por la mayoría de células. Poseen un gran interés debido a sus diversas implicaciones en todos los seres vivos. En el caso de los seres humanos pueden estar asociadas con condiciones patológicas, incluyendo cáncer y enfermedades neurodegenerativas. En las bacterias, las vesículas de membrana externa (OMVs) están implicadas en la comunicación celular y en la patogenicidad bacteriana regulando las respuestas inmunes y reacciones de inflamación. Por estos motivos las vesículas son candidatos prometedores como marcadores de diagnóstico de diversos trastornos de salud o de enfermedades causadas por patógenos. Por lo tanto las expectativas médicas son enormes. Debido a todo ello, el progreso de las herramientas de diagnóstico basadas en vesículas requiere el desarrollo de tecnologías de detección capaces de cuantificarlas en muestras biológicas complejas. Además, la disponibilidad de herramientas para caracterizar OMVs de tamaño nanométrico es igualmente importante en la investigación, donde la elucidación del modo de acción de estas debe correlacionarse tanto con sus propiedades fisicoquímicas como con su concentración en la muestra experimental. Actualmente la mayoría de estudios van dirigidos al análisis del contenido presente en dichas OMVs pero son muy escasos aquellos que se centren en el recuento de OMVs, ya que no hay consenso en la comunidad científica sobre qué metodología emplear que permita llevar a cabo una visualización y recuento de forma rutinaria con una significación estadística suficiente. Por ello, este TFG pretende poner a punto y optimizar una técnica basada en microscopía electrónica que permita visualizar inequívocamente y cuantificar OMVs en una muestra. Para ello, se pusieron a punto dos metodologías, una basada en microscopía electrónica de transmisión (TEM) y otra en microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM). El método basado en TEM resultaría efectivo para visualizar las OMVs aunque subestima la abundancia de OMVs por lo que habría que optimizarlo en investigaciones posteriores. El principal inconveniente de este sería que requiere una gran manipulación y largos tiempos de espera. Los resultados obtenidos basados en el recuento de OMVs por FE-SEM indicarían que esta variante de la técnica sería probablemente la forma más cómoda, rápida y efectiva para la visualización de OMVs. Así, la metodología consistió en filtrar directamente y depositar las OMVs sobre una membrana de polietersulfona (PES) con un tamaño de poro de 10 kDa que se lavaría posteriormente con el buffer HEPES. Tras ello, se visualizarían con el FE-SEM. Sería la mejor técnica ya que prácticamente no aparece contaminación que interfiera en la visualización y únicamente se visualizan las OMVs. La cuantificación llevada a cabo en el FE-SEM podría considerarse más fiable que la del TEM ya que permite una mejor visualización incluso en planos abiertos y no aparecen cuerpos extraños que interfieran en el recuento. No obstante, se necesitarían investigaciones futuras para confirmar la robustez y fiabilidad del recuento de ambas técnicas.